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大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書
更新時間:2015-05-20 點擊量:1572

大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書

 

 

MaxiGel Extraction Kit

號:  YJ0518

保   存:  室溫

組分說明

Cat.No.

YJ0518

50

KitSize

BufferPG

100ml

15ml

10ml

10ml

50

BufferPS

BufferPW(concentrate)

BufferEB

SpinColumnDL 

CollectionTube(2ml)

50

產(chǎn)品簡介

     本試劑盒采用新型硅基質(zhì)膜技術(shù),通過快速,簡單的結(jié)合-洗滌-洗脫步驟可從大量普通或低熔點瓊脂糖凝膠中回收純

化 50bp-50kb 的 DNA 片段,溶膠速度快,每個吸附柱zui高可吸附 30 μg 的 DNA,純化過程中有效去除引物、核苷酸、

酶、礦物油、瓊脂糖等雜質(zhì),獲得高純度,完整性好的 DNA 片段,回收率高達 90%。本試劑盒回收純化的 DNA 可直接用

于測序、連接和轉(zhuǎn)化、酶切、標(biāo)記、體外轉(zhuǎn)錄等分子生物學(xué)實驗。

注意事項

1..*次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在BufferPW中加入無水乙醇。

2.使用前請檢查BufferPG是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀,如有結(jié)晶或者沉淀現(xiàn)象,可在37℃水浴幾分鐘,即可恢復(fù)澄清。

3.電泳時使用新的電泳緩沖液,以免影響電泳和回收效果。

4.切膠時,紫外照射時間應(yīng)盡量短,以免對DNA造成損傷。

5.回收率與初始 DNA 量和洗脫體積有關(guān)。

6.所有離心步驟均為使用常規(guī)臺式離心機室溫下進行離心。

自備:無水乙醇,離心管

 

操作步驟

 

1. 將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分),放入干凈的離心管(自備)中,稱取重量。 

注意:若膠塊的體積過大,可將膠塊切成碎塊。

2. 向膠塊中加入3倍體積Buffer PG;當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度>2%時,建議使用6倍體積BufferPG(如凝膠重為100mg,其體積可視為100μl,依此類推)。

3. 50℃孵育10分鐘,其間不斷溫和地上下顛倒離心管,以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊,可再補加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘,直至膠塊*溶解。

注意:1)在膠充分溶解后檢測pH值,若pH值大于7.5,可向含有DNA的膠溶液中加10-30μl 的3M醋酸鈉(pH5.0)將pH值調(diào)到5-7。

      2)膠塊*溶解后將膠溶液溫度降至室溫再上柱,因為吸附柱在較高溫度時結(jié)合 DNA 的能力較弱。

4.(可選步驟)當(dāng)回收片段<500bp或>4kb時,應(yīng)加入1倍膠體積的異丙醇,上下顛倒混勻(如凝膠為100mg,則加入100μl異丙醇)。

注意:當(dāng)回收片段為500bp-4kb時,加入異丙醇不會影響回收率。

5.柱平衡:向已裝入收集管(CollectionTube)中的吸附柱(SpinColumnDL)中加入200  μl Buffer PS,12,000rpm(~13,400×g)離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

6.將步驟3或者步驟4所得溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中,室溫放置2分鐘,12,000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。

注意:吸附柱容積為700μl,若樣品體積大于700μl 可分批加入。

7.(可選步驟)向吸附柱中加入500μlBufferPG,12,000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。

注意:如果后續(xù)實驗用于直接測序、體外轉(zhuǎn)錄或顯微注射,推薦用此步驟以除去所有凝膠。8. 向吸附柱中加入650 μl Buffer PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12,000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。

9. 注意:如果純化的DNA用于鹽敏感的實驗(例如平末端連接或直接測序),建議加入BufferPW靜置2-5分鐘再離心。12,000rpm離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘,以*晾干。

注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除,乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響,建議將吸附柱開蓋,置于室溫放置數(shù)分鐘,以*晾干吸附材料中殘余的乙醇。

10.  將吸附柱放到一個新離心管(自備)中,向吸附膜中間位置懸空滴加100 μl Buffer EB(pH 8.5),室溫放置2分鐘。12,000rpm離心2分鐘,收集DNA溶液。-20℃保存DNA。注意:1) 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液,應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)。

2) 為了提高DNA的回收量,可將離心得到的溶液重新滴加到吸附柱中,重復(fù)步驟10。

3) 洗脫體積不應(yīng)小于50μl,體積過少會影響回收效率。

4) 如果使用TE洗脫,需要考慮其中含有的EDTA是否會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。

5)回收大于10kb的DNA片段時,BufferEB應(yīng)在50℃水浴中預(yù)熱,適當(dāng)延長吸附和洗脫時間,可增加回收效率。

 

 

 

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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